全内反射荧光(TIRF)显微镜

什么是全内反射荧光(TIRF)，它是如何工作的?

全内反射荧光(TIRF)使用倏逝波来照亮和激发紧靠玻璃-水界面的选定荧光体。
倏逝电磁场在远离界面时呈指数衰减，因此它只能穿透到样品介质的100nm深度。因此，TIRF可以选择表面区域，如约7.5nm厚的基底质膜，用于显示。视野至少为300nm宽，因此细胞质区也可见。活细胞质膜上的特征和事件因此被选择性地以高轴向分辨率显示出来。

使用TIRF甚至可以观察单个分子的荧光。生物物理学家和定量生物学家因此可以通过使用这种设备和技术大大受益。检测DNA生物标记物的单个分子，SNP鉴别也可能与这种TIRF显微镜。

顺式几何(通过物镜的TIRFM)提供了不同质量的全内反射效果。物镜型TIRFM与显微镜的物镜和其他光学元件相同。在这种情况下，衰减波被强烈的杂散光所污染，杂散光约占波的10-15%，这使得客观型TIRFM数据的解释有些问题。

trans几何结构(基于棱镜和光波导的TIRFM)是另一种选择。在这种情况下，激发光路和发射通道是分开的。基于棱镜的几何产生一个干净的衰减波与指数衰减非常接近理论预测的函数。

E.J.Ambrose是第一个描述使用全内反射的用来照亮与玻璃表面接触的细胞的用途，在1956年。到1980年代，密歇根大学的丹尼尔阿克罗德延伸了这个想法并创造了缩略词Tirf。

什么是TIRF显微镜?

全内反射荧光显微镜(TIRFM)是一种用于观察样品薄片的显微镜，通常小于200纳米厚。

传统的荧光显微镜已经被分子和细胞生物学家用来观察细胞表面的分子活动，如细胞粘附，神经递质的分泌，细胞与激素的结合，以及膜动力学。

然而，当试图观察与样品表面结合并与周围介质处于平衡状态的荧光团时，就会出现问题。当被激发时，更多的非结合分子在背景中发出荧光，淹没了与表面结合的荧光团。

这就是TIRF的用武之地。它允许选择性地激发表面结合的荧光团，而不激发背景中的非结合分子。由于它可以只选择亚微米表面，因此是单分子检测显微镜的最佳选择。

如何配置TIRF显微镜?

在TIRFM仪器开发和测试的早期阶段，广泛的光谱光学配置进行了密切的审查。这种强烈的观察和分析的结果是，许多设计可以在折射率不同的两种材料的交界处产生必要的薄的倏逝场。

大多数的TIRFM设计采用倒置的显微镜配置，因为这最好允许放置TIRFM光学在庞大的显微镜级之上，而不是在它下面，否则将是必要的。有些型号采用立式显微镜配置以降低成本——尽管考虑到实验条件，这种配置有时也是最好的选择，即使预算允许更昂贵的配置。这种情况的一个例子是观察细胞底物与生长在塑料培养皿底部单层培养液中的细胞的接触。当观察者希望使用带有浸渍锥的水浸物镜时，这一点尤其正确。然而，当检测附着在密封标本室上部的细胞或膜组件时，beplay sports 更高效。当物镜被用来照亮和从被观察的标本中检索二次荧光发射时，这也是正确的。

大多数的TIRFM配置，无论显微镜的基本设计，都采用(并依赖)一个添加的棱镜来引导激光照明的界面在样品共轭平面，在那里发生全内部反射。物镜还可以直接照明，在界面捕获二次荧光。这种二次荧光是由受激发的荧光团产生的。本讨论假设样本生长在一个单层中，附在全内反射界面的玻璃覆盖层上，它由用一种或多种荧光染料标记的组织培养细胞组成。

TIRFM仪器配置通常包括倒置的组织培养显微镜、外部激光照明、梯形棱镜块和光电倍增管/CCD组合探测器系统。激光器发出蓝光，蓝光被(恰当地命名)扩展器扩展，然后被分光器分裂。分束器将光分束在光束引导镜和显微镜入口之间。

从引导镜表面反射的那部分光被聚焦透镜聚焦到梯形棱镜上。棱镜正好位于标本室和物镜上方的舞台上。然后由棱镜将照明导向TIRF界面，其角度略大于内部全反射的关键角度。这就产生了一个足以激发标本中的荧光团的倏逝场。

被劈开并对准显微镜端口的那部分光可以通过光学序列定向，也可以定向到标本，但这束光可以产生宽场的外荧光激发。

二次荧光，即标本发出的荧光，被物镜收集，并通过三个目的地之一——目镜、CCD相机系统或光电倍增管(PMT)。棱镜的顶部是平的，所以在发射模式下，使用各种增强对比度的技术，从钨卤素灯箱的照明可以用来观察样品。所使用的技术包括霍夫曼调制对比度、暗场、差分对比度和相位对比度。

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来源:
https://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0100526
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4540339/
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2111781/