荧光显微镜-解释和标记图像

荧光显微镜是如何工作的?

荧光显微镜通过将光学显微镜的放大性能与化合物的荧光性质组合结合而成。荧光显微镜使用高强度光源，可激发称为荧光团的荧光分子在观察到的样品中。样品用荧光团标记，在那里它们从源吸收高强度光并发射较长波长的较低能量光。然后将所得荧光与过滤器与周围辐射分离，允许观察者只看到荧光材料。得到的图像是研究的样本的放大版本。

当今生物学中使用的大多数荧光显微镜是外荧光显微镜。激发和荧光观察都发生在样品上方。

什么是荧光显微镜?

一个荧光显微镜用于研究有机和无机样品。荧光显微镜使用荧光和磷光来检查样品的结构组织和空间分布。它特别用于研究复杂的样品，不能在传统的透射光显微镜下检查。荧光显微镜图像有助于研究低浓度的物质，而高灵敏度是检测它们的关键。

荧光显微镜的特点

荧光显微镜的主要部分与传统光学显微镜重叠。然而，荧光显微镜与传统显微镜有两个主要特点。一个是光源的类型，另一个是专门滤光片的使用。荧光显微镜使用更高强度的光来照射样品。

荧光显微镜的一部分

强大的光源（氙气或汞拱灯）当前位置汞灯发出的光比大多数白炽灯亮10-100倍，并提供从紫外线到红外线的广泛波长的光。

激发滤:激发滤光片的作用是滤除光源的所有波长，但被检测荧光团的激发范围除外。图像的亮度和亮度由滤光片的最小透射率决定。理想的传输速率为>85%。

二色镜(分束器):二色镜或分束器放置在激励滤波器和发射滤波器之间的45°角。二色滤波器的作用是将激励信号反射到荧光团，并将发射信号发射到探测器。

发射滤光片:发射滤光片位于荧光显微镜的成像路径内。它的工作是过滤出整个激发范围，并传送被检查的荧光团的发射范围。

物镜物镜的作用是将光线传送到样品上，使其成像。光线在到达物镜之前通过二色镜。

摄像系统:摄像机系统有助于记录标本的高分辨率图像。该系统通常使用CCD(电荷耦合器件)相机。这些电子倍增相机擅长在不损失灵敏度的情况下对单个光子事件进行成像。它们不需要图像增强器，图像可以高速捕获。

荧光显微镜的用途是什么?

荧光显微镜应用于生物学、生物医学和材料科学。荧光显微镜的独特功能有助于识别细胞和亚显微镜细胞成分的准确性和细节。

荧光显微镜广泛应用于组织化学领域，用于检测传统显微镜无法观察到的神经递质胺等颗粒。

它在食品化学中用于评估产品中特定食品成分的存在、结构组织和空间分布。

荧光成像的另一种用途是荧光斑点显微镜。它是一种使用荧光标记的大分子组件，例如细胞骨骼蛋白，以研究运动和周转率。

荧光显微镜染色也有助于矿物学应用领域。通常用于研究煤，氧化物，氧化物等矿物质。

它在纺织工业中也被广泛应用于分析纤维尺寸。表面荧光显微镜有助于研究包括纸张和纺织品在内的纤维基材料。

使用荧光染料，荧光显微镜是研究陶瓷孔隙率的理想方法。它也适用于半导体的研究。

荧光显微镜下的光源

荧光显微镜使用高强度的近单色照明，因此需要四种主要类型的灯之一:氙灯或汞蒸气灯(带有激励滤波器)、超连续光源、大功率led或激光器。激光是共聚焦显微镜最常见的选择，全内反射荧光显微术，以及其他复杂的技术。在使用大视场荧光显微镜的情况下，氙灯、汞灯或带有二色激励滤光片的led灯更合适。宽视场荧光显微镜照明路径上的两个微透镜阵列可以产生1 ~ 2%的照明变异系数，具有较高的均匀性。

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荧光样品制备

毫无疑问，样品必须是荧光的，以适合荧光显微镜，但几句话准备样品的观察可能是有用的。存在不止一种方法，最常见的方法包括用荧光染色标记、表达荧光蛋白或利用样品的固有荧光(自体荧光)。荧光显微镜是生命科学中常用而强大的工具。

显微数字化

在渗流荧光显微镜中，激发波长的光通过物镜通过物镜照射样品。相同的目标将荧光聚集到探测器上。该物镜通常具有更高的分辨率的数值孔径。大多数光通过样本传递，因此仅反射兴奋性光通过到物镜，以及发射的光。ePiforEgence方法产生较高的信号与噪声比，从而为观看者产生更好的图像。

波长被二色光束分配器过滤，它将不需要的激发光反射回光源，但允许荧光通过观察者。

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生物荧光染色

一些污渍可用于各种各样的生物物质。一些小分子具有它们自己的荧光和优选的生物分子，其键合。实例包括DAPI和Hoechst，由UV光激发;和DRAQ5和DRAQ7，在红灯下最好的兴奋。这些中的每一个都结合到DNA的次要凹槽中，并通过这样做，突出显示（或“标记”）细胞核。

其他一些染色是多肽、毒素和药物，并与特定的细胞结构结合。这些必须首先与荧光报告衍生，以工作。Phalloidin是这种荧光染色的一个很好的例子。它主要用于哺乳动物细胞中的肌动蛋白纤维染色。胶原杂交肽是另一种新的，可以用于变性的胶原纤维。结合纤维素或果胶的染色剂和染料是植物细胞壁染色的好方法。许多被称为荧光团或荧光色素的荧光分子可以(化学上)连接到不同的分子，以便将它们与样品中感兴趣的目标结合。荧光素、Alexa Fluors和DyLight 488就是这些例子。

即使有了这些优秀的荧光探针，研究人员仍在不断地寻找新的、更具体的候选者，特别是那些能够对植物细胞进行活体成像的候选者。

免疫荧光

抗体与抗原的高度特异性结合，从而标记细胞内的特定蛋白质或其他分子，通过一个称为免疫荧光．这个过程开始于用一种针对观察者希望标记的分子的一抗来处理样本。有时这是通过将二抗与与第一抗体结合的荧光团结合来实现的，结果是相同的标记。例如，老鼠体内的一种主要抗体可能识别微管蛋白。如果将其与由荧光团衍生的二次抗小鼠抗体结合，观察者就可以标记细胞中的微管。

荧光蛋白

现代遗传知识和技术允许科学家修改DNA。同样的技术可以用于基因修饰蛋白质，添加荧光蛋白报告，这意味着科学家可以使某种蛋白质荧光。一旦它是荧光的，就可以直接追踪，甚至在活细胞中。

进一步的阅读

你可以在下面了解更多关于荧光显微镜的知识:

• 宽场荧光显微镜
• 荧光的历史
• 荧光显微镜与光学显微镜

来源:
http://www.scholarpedia.org/article/Fluorescent_proteins
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/18228363/
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4711767/