由Fred Koenig于2020年12月15日发布
广域荧光显微镜和荧光团的解释
什么是宽视野荧光显微镜?
在宽视野荧光显微镜中，整个样品被特定波长的光照亮。荧光分子被激发并发出自己的光，这种光可以通过目镜或相机观察到。
细胞的识别和可视化可以使用这种技术，就像整个视野的2D图像一样。通过这种方式，即使是活的进程也可以被实时观察到，比如神经元信号传递。
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荧光团解释
每种类型的荧光分子都被特定波长的光激发，从而可以使用不同的染料分离某些结构。光被荧光团分子吸收，进入激发态。当它们回到基态时，就会发出更长波长的光（称为“发射波长”）。这被视为荧光。
有时，知道激发波长和地面波长之间的区别是有用的，这种测量被称为“冲程位移”。每个荧光团都有一个可以吸收和发射的波长范围。这被称为特定荧光团的“发射光谱”。由于这是一个范围，每个荧光团有一个激发的峰值波长以及一个发射的峰值波长。两种光谱之间的差异使得在同一样品中可以区分不同的目标结构。
荧光团甚至可以用来识别生物样品中的特定部分或结构。一些生物结构中已经有自己的荧光团自然存在——叶绿素就是一个常见的例子。DNA也可以被改变，在其他非荧光生物组织中产生荧光，甚至在活体组织中。抗体可以用小分子荧光团标记，然后引入样本中——德克萨斯红经常以这种方式使用。
研究人员已经开发出能够在可见光光谱中发出颜色的荧光团。绿色荧光蛋白(绿色)、上述的德克萨斯红(红色)和4 '，6-二氨基-2-苯基吲哚- DAPI(蓝色)是常见的例子。
荧光显微镜是如何工作的?
在荧光显微镜中，光通过只允许特定波长通过的激发滤光片照射。
选择特定的滤光片设置，允许通过特定的波长激发特定的荧光团，荧光团被激发并发出自己的光。
这种光从二向色镜反射，被物镜聚焦，然后照射到样品上。当激发光照射到样品时，样品中的荧光团被激发，然后回到基态，此时它们发出自己的波长更长的光。
物镜收集部分光线，这些光线通过二色镜通过发射滤光片传输，没有滤光片的光线继续进入目镜或相机观察。
因为激发光和发射光都通过同一物镜，所以这种技术被称为外延荧光。“Epi”来自希腊语，意思是“相同”
一种叫做“滤光立方体”的结构通常包含激励滤波器和二向色镜。这个滤镜立方体减少了干扰光，即所谓的“噪声”，使图像变得模糊，或使所需的发射光被环境光淹没。
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在荧光显微镜中使用相机
在学校时，我们大多数人都使用带目镜的显微镜，但如果想拍摄一幅图像供日后分析，就需要一台照相机。与显微镜配套使用的相机包含数百万个二极管，每个二极管都带有一个半导体传感器，可以将任何照射到它的光线转换成电流。电荷耦合器件（CCD）和互补金属氧化物半导体（CMOS）构成了最常见的半导体。相机的最佳选择取决于具体情况——例如，所需的帧速率、噪音水平和灵敏度。
被称为sCMOS的科学CMOS相机提供低噪声和快速帧速率，但其动态范围和分辨率很高，并且可以在广阔的视野中提供这一点。这些相机适用于在低照度条件下进行高保真定量研究。
另一种能够快速检测低光荧光的相机是电子倍增CCD相机。利用冷却的CCD相机，可以逐步积累高分辨率、低噪声的荧光信号。
荧光显微镜中的光源
现代光源通常是发光二极管，俗称led。他们有能力密切控制其波长和强度，他们是经济的，冷却运行，不需要校准，他们是紧凑和轻的结构。总而言之，他们非常适合这个目的-比电弧灯和钨卤灯更好，过去是唯一真正的选择。
汞弧灯或氙弧灯允许对波长进行密切控制，但其强度高，产生大量热量，可使样品发生光漂白或光中毒。它们也很难以对环境负责的方式进行处理，而且寿命不如LED。
卤钨灯的光毒性风险不高，且比汞或氙灯便宜，但其强度较低，无法充分激发弱荧光团进行良好观察。
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图像分辨率的限制
宽场显微镜产生的高分辨率图像可能有一些局限性。
整个样品都被照亮，这使得很难分辨荧光产生的深度——而且样品越厚，问题就越明显。
对于活细胞和组织的观察，发射光贯穿整个样品，散射荧光会使图像模糊，使三维成像无效。
在这种情况下，荧光反褶积显微镜和结构照明显微镜可以解决这个问题。
最好的配置
样品的照明可以来自于垂直显微镜的上方，也可以来自于倒置的下方。后者最适合观察培养的活细胞，但当观察固定样本时，如组织切片，直立式最好。
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